分析软件操作手册（Correlation Analysis V3.6）
发布时间：
2023-05-04
分类：
CorTector
软件操作手册
Correlation Analysis
V3.6
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1.2.6 以Calibration文件的形式载入文件.... 16
1.数据分析流程
1.1 数据文件的导入
使用Correlation Analysis软件可对Correlation Acquisition软件采集的数据进行分析处理。对于数据文件的导入，一般可分为单个文件和整个文件夹的导入两种方式。
1.1.1 导入单文件
点击File->Open选项，通过文件选择框导入指定的数据文件。
图1-1 菜单Open选项
图1-2 文件选择框
选择需要导入的文件后，点击打开，即可将文件导入到界面左侧的文件列表框处，如图1-3所示：
图1-3 导入至文件列表中
1.1.2 导入文件夹
点击文件列表框右上角的“···”形式的按钮，如图1-4所示，会弹出文件夹选择框，通过选择指定文件夹，可导入该文件夹下的所有数据文件。导入成功后，如图1-6所示。
图1-4 导入文件夹按钮
图1-5文件夹选择框
图1-6 成功导入指定文件夹下的数据文件
此外，用户可通过文件列表处的下拉菜单，查看最近导入的历史记录，可根据需要进行选择导入对应路径下的文件。
图1-7 下拉菜单可查看历史记录
1.2 数据文件的加载及右键菜单功能
1.2.1 单文件的加载
成功导入文件后，用户可自行在文件列表中选中需要加载的文件，双击鼠标左键，即可完成对指定数据文件的加载。加载成功后，文件名的前方会有“>>>”样式的标记，如图1-8所示，并且会默认选择数据通道和拟合模型，显示对应的数据图像。
图1-8 文件加载成功的标记
图1-9 文件加载成功后的界面
1.2.2 多文件的加载
对于多文件的加载，用户在文件列表中可通过按住鼠标左键，进行拖拉框选需要载入的文件，如图1-10所示，也可以按住键盘的Ctrl键根据需要有选择性地进行多选，如图1-11所示。
图1-10 拖拉框选多文件
图1-11 通过Ctrl键有选择性地选择多文件
用户选择完需要加载的文件后，在文件列表处点击鼠标右键唤出右键菜单，通过菜单中的“Batch Load”来完成多文件的载入。
图1-12 通过右键菜单的Batch Load载入多文件
同样地，成功加载后，文件名前都会有“>>>”样式的标记，如图1-13所示，并且“Data”区域的上方处会出现下拉菜单，用户可通过该菜单对载入的文件进行切换，并进行后续操作。
图1-13 载入多文件后的标记和文件切换
1.2.3 校准参数的载入
实验数据分析前需要载入分析后的标准荧光分子数据作为校准参数，载入的方式有两种，一种是校准文件已导入至文件列表，选中文件后，通过右键菜单中的“Load Calibration Parameters”来载入校准参数，载入成功后，在“Fitting Parameters”表格上方的按钮会变为绿色，并且当鼠标指针悬停在按钮上会显示对应通道的校准文件路径信息，如图1-15所示，用户可根据需要勾选固定/放开的参数再进行后续的拟合操作。
图1-14 通过右键菜单载入校准文件
图1-15 成功载入校准文件后的界面
而另一种就是通过“Fitting Parameters”表格上方的“Load Calibration Parameters”按钮来载入校准文件，如图1-16所示，点击后，选择相应的文件即可。这种方式可以载入指定路径的校准文件，载入成功后，同样地会出现可固定的参数，默认固定参数S，并且将S及其error值更新至表格中。
图1-16 通过Load CalibrationParameters按钮来载入校准文件
图1-17 Load Calibration Parameters文件选择框
1.2.4 显示数据采集时的状态信息
在分析数据时，若需要查看数据采集时的仪器状态参数，此时可在文件列表中选中一个需要查看状态的文件后，通过右键菜单中的“Display Instrument Status”即可查看对应文件在采集数据时的状态信息，该消息会显示在界面的右方。如图1-18所示。
图1-18 通过右键菜单查看状态信息
上述方式主要是针对未载入数据文件，直接在文件列表中操作查看数据文件在采集时的状态信息，若已载入数据文件，用户可以通过界面上方的“Instrument Status >>”按钮直接显示状态信息，并且可以通过“Instrument Status Hide <<”按钮来隐藏状态信息的界面。
图1-19 状态信息显示按钮
图1-20 状态信息隐藏按钮
此外，载入数据后，用户可根据个人习惯，可通过文件列表处的按钮对该区域进行隐藏/显示，若下图所示：
图1-21 文件列表隐藏按钮
图1-22 文件列表隐藏后的界面
1.2.5 文件的重命名功能
在文件列表中，用户可对导入的文件进行重命名，具体操作是，选中需要重命名的文件，右键选择“Rename”，在弹出的框中的“New Name”项填入修改的文件名，点击“OK”即可修改，并且会更新至文件列表中。
图1-23 右键菜单的Rename选项
图1-24 Rename命名框
图1-25 重命名后更新至文件列表
1.2.6 以Calibration文件的形式载入文件
新版的数据文件在载入时，会自动区分文件类型，但对于旧版的数据文件，用户需要自行区分。在文件列表中，选中需要进行分析的旧版校准文件，在右键菜单中选择“Load as Calibration File”，即可进行加载。
图1-26 以Calibration文件形式加载
载入文件后，需要用户手动选择荧光校准因子后，方可进行正常的拟合和计算操作。
图1-27 选择荧光校准因子
1.2.7 快速打开数据文件夹
在文件列表中右键唤出菜单，选中“Show in Explorer”选项，可以打开数据文件所在的文件夹。
图1-28 Show in Explorer选项
1.3 数据通道选择及拟合模型选择
1.3.1 数据通道选择
成功载入数据后，软件会根据数据采集时所用的探测器，选择默认的数据通道，在数据通道选择区域，用户可以点击查看各通道的源数据及光强的图像、均值图像。
图1-28 数据通道选择区域
图1-29 源数据及其均值图像的显示
图1-30 光强及其均值图像的显示
1.3.2 拟合模型的选择
同样地，在载入数据后，软件会选择默认的拟合模型“Single 3D Diffusion + Triplet Dynamics”，当然用户可以根据实际情况，在该区域的下拉菜单处选择需要的拟合模型。
图1-31 拟合模型显示区域
图1-32 拟合模型选择
1.4 拟合与计算
1.4.1 拟合起始点与终止点的选择
当确认好数据通道与拟合模型时，用户可点击“Fit”按钮，此时，出现默认选点提示框，点击“Yes”将以默认点进行拟合，若点击“No”，则重新选点。如下图：
图1-33 点击Fit按钮后出现默认选点提示框
重新选点时，将鼠标移至图像区域，指针会变成十字标，用户点击即可选择，选择起始点后，用户可按住“Alt”键不放，继续选择终止点，当然，若不选择终止点，软件会给予一个默认的终止点。
图1-34 选择起始点与终止点
1.4.2 拟合参数的初始化
在选择拟合起始点时，可看见表格出现默认的初始化参数，用户可根据拟合需要，通过表格上方的复选框，勾选需要固定的校准参数，勾选后，参数会固定至表格中，如下图展示了固定S、TauT的情况：
图1-35 固定拟合参数至表格中
1.4.3 进行拟合与计算分析
待确认完拟合点和初始参数后，再次点击“Fit”按钮即可进行拟合与计算的操作。拟合完成后，会弹出提示框，如下图所示：
图1-36 拟合完成提示
拟合完成后，用户可点击“Fitting Parameters”表格中的单元格（可多选），查看对应行数据的曲线图像，并且可用鼠标单击或框选图像区域进行放大，双击即恢复正常比例。
图1-37 查看数据图像
现在，用户可通过曲线图像下方的Legend表格，点击曲线图例即可对对应的曲线进行高亮显示。
图1-38 放大并高亮显示数据曲线
同样地，用户若需重新选择拟合点，可在拟合完成后再次按“Fit”按钮，在弹出的提示框中，点击“No”即可重新选点。
此外，对于多文件载入的拟合计算处理，用户通过“Batch Load”操作后，可选择通道选择区域上方下拉菜单中的“Show all the curves”项，再点击“Fit”按钮即可进行多文件的自动拟合；当然，用户也可以在进行完一个文件的拟合和计算后，在“Data”栏的上方下拉菜单，对各文件进行切换，再手动进行下一个文件的拟合和计算，或者查看已拟合好的其它文件。
图1-39多文件的切换
1.4.4 异常数据标记与处理
拟合完成后，用户若对某行数据不满意，可选中表格对应行的单元格，右键唤出菜单后点击“Mark”选项，即可对对应行的数据进行标记，并且可标记多行数据；重新拟合时，软件自动忽略该行的数据进行拟合。当然，用户若标记有误，可选择“Unmark”进行取消标记。若点击的是“Delete”选项，则可删除所选行的拟合数据以及对应曲线。
图1-40 右键菜单对表格数据进行标记
图1-41 标记多行后的表格
1.5 样品数据的分析流程
在以上章节中，对软件的基本操作做了介绍，对于标准荧光分子的数据文件的分析，直接载入文件进行拟合操作即可；而对于样品数据文件则需要在分析之前，确保已载入校准参数，而校准参数来自于已分析的标准荧光分子的数据文件，通过上述的“Load Calibration Parameters”操作即可完成校准参数的载入。
2.分析后的数据保存
2.1 分析数据的保存
完成分析后，用户可点击菜单栏中的File->Save选项，在弹出的文件保存框对已分析的数据进行保存。
图2-1 菜单栏的Save选项
图2-2 Save文件保存框
通过上图中的文件保存界面，用户可以选择本次载入分析的文件进行保存，其中，用户可通过表格中的“Select”列复选框选择需要保存的文件；在“File Name”列中，软件会给予默认的保存文件名，用户可以直接在表格中修改文件名；而在“Type”列中，则提供保存的文件类型，包括mat、xls、txt三种格式（注：由于数据量大，加上txt本身特性，保存txt格式的文件可读性差，建议使用其余两种格式保存文件）。而在表格下方的Path栏中，用户可点击右方的文件夹图标，进行保存文件路径的选择，确认上述信息后，点击Save方可保存。
此外，菜单栏中的File->Save All选项，保存方式与Save功能一致，该功能项的不同之处在于，Save All可以保存非当前分析的文件，也就是说，用户可以进行多批次的文件分析后，最后对文件进行统一保存。
对于已保存的文件，用户可通过以载入数据文件的方式，对已分析的文件进行载入，这样就可以对已分析的文件进行查阅。
2.2 图像及其绘图数据的保存
2.2.1 对拟合图像及绘图数据的保存
拟合完成后，用户在表格中点击需要保存的图像或绘图数据所对应行，然后点击界面右上角的“Save Results”按钮，在弹出的界面中，用户可自行选择需要保存的数据、范围、类型等，确认保存的路径和文件名后点击“Save”即可保存。
图2-3 Save Results按钮
图2-4 Save Results界面
2.2.2 对归一化图像及坐标数据的保存
对于归一化图像及其数据的保存，用户在需要点击界面右上角的“Normalization”按钮进行归一化操作，然后点击“Save Results”方可进行保存。
图2-5 进行归一化操作
图2-6 选取0.01(ms)至0.1(s)区间保存图像
2.2.3 对源数据图像及坐标数据的保存
对于源数据的图像及其数据的保存，用户只需在“Data”区域，点击选择需要保存的源数据通道（Raw Correlation或Intensity），再点击“Save Results”即可进行保存。
图2-7 通道选择区域
3. 其它功能
3.1 FCS曲线数据筛查功能
在软件界面的右上方点击“Data Screening”按钮，可进入数据筛查模式，该模式允许用户对某些不合理的FCS曲线进行剔除，仅保留余下的数据进行分析。
图3-1 Data Screening按钮
图3-2 进入筛查曲线模式
在弹出的提示框中点击“OK”后，用户可在图像显示区域，选择需要删除的曲线（可选多条），可通过单击对曲线进行选中/取消选中，此外，用户可点击曲线附近的空白处对图像进行放大。选中后，点击右上角“Delete Curve”按钮，即可对曲线进行删除。用户若误删了曲线，只需重新加载文件即可恢复。
图3-3 选中需要删除的曲线
图3-4 放大后选中多条曲线
3.2 背景校正功能
在菜单栏中选择“Background Correction”项，可导入背景文件，成功导入后，菜单栏会显示背景文件的路径并以绿色字体显示，此时，图像显示区域会显示背景文件的光强。背景扣除功能使用的先决条件一般为：背景缓冲液存在较强的荧光信号，但一般不超过待测样品荧光强度的5%，且不存在自相关性。
图3-5 成功导入背景文件
导入背景文件后，此时，用户在文件列表中载入文件均会对原始数据进行背景数据的扣除。
此外，用户可通过再次点击菜单栏中的“Background Correction”项来退出背景扣除状态。
3.3 拟合初始参数修改功能
在菜单栏的“Edit”项中，点击“Parameter Editing”选项可开启或关闭参数编辑功能；当标记为“√”时表示开启，反之表示关闭。
图3-6 Parameter Editing项
开启参数编辑功能后，用户即可在拟合参数表格中，选中需要修改的拟合初参的“Mean”行数据，输入指定初值，输入后按下回车键即可完成修改，再次拟合时，软件会根据你所设置的初参进行拟合。此外，若需要重新使用校准文件的参数作为拟合初参，则只需重新执行“Load Calibration Parameters”操作即可。
图3-7 修改T值拟合初始参数
附录1：标准荧光分子扩散系数表
|
Fluorophore |
λEm (nm) |
Diffusion coefficient (μm2 s-1) |
Methods |
|
Atto655-maleimid |
686 |
407 ± 10 |
2fFCS, PFG-NMR |
|
406 ± 9 |
2fFCS |
||
|
409 ± 7 |
pmFCS |
||
|
Atto655-carboxylic acid |
685 |
426 ± 8 |
2fFCS, PFG-NMR |
|
Atto655-NHS esther |
685 |
425 ± 6 |
2fFCS |
|
Atto488-carboxylic acid |
523 |
400 ± 10 |
2fFCS |
|
Cy5 |
670 |
360 ± 10 |
2fFCS |
|
Alexa 647 |
665 |
330 ± 10 |
2fFCS |
|
Alexa 633 |
647 |
340 ± 10 |
2fFCS |
|
Alexa 546* |
572 |
341 |
2fFCS |
|
Alexa 488* |
520 |
435 |
2fFCS |
|
eGFP* |
510 |
95 |
2fFCS |
|
Rhodamine 6G |
550 |
414 ± 5 |
2fFCS |
|
430 ± 40 |
PFG-NMR |
||
|
414 ± 1 |
PB/CF |
||
|
Rhodamine 123 |
530 |
460 ± 40 |
PFG-NMR |
|
Rhodamine 110 |
535 |
470 ± 40 |
PFG-NMR |
|
Fluorescein |
520 |
425 ± 1 |
PB/CF |
|
Oregon Green 488 |
550 |
411 ± 6 |
2fFCS |
|
410 ± 8 |
|||
|
TetraSpeck Beads, 0.1μm diameter |
430 |
4.4 ± 7.0 |
2fFCS, DLS |
|
515 |
|||
|
580 |
|||
|
680 |
Diffusion coefficients measured in water solutions at 25℃ (298.15 K), except for those marked with *, which were obtained at 22.5℃ (295.65 K).
Abbreviations of measurement methods.
2fFCS. Dual Focus Fluorescence Correlation Spectroscopy:
PFG-NMR, Pulsed Field Gradient Nuclear Magnetic Resonance:
pmFCS, Polarization-Modulation Fluorescence Correlation Spectroscopy;
PB/CF, Plug Broadening/Capillary Flow;
DLS. Dynamic Light Scattering.
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