CorTector

软件操作手册

ALEX smFRET

V1.0

目录

0.简介.... 3

0.1软件总体功能.... 3

1.数据文件与数据读取、输出.... 4

1.1数据文件.... 4

1.2读取文件.... 4

1.3文件保存与输出结果... 5

2.数据勘探.... 6

2.1简介.... 6

2.2光子时序信号图.... 6

2.3背景信号.... 7

2.4 E-S二维直方图.... 9

2.5 Burst Search. 10

2.6 Burst Selection. 11

3.Burst 分析.... 14

3.1 简介.... 14

3.2 表格.... 14

3.3 直方图.... 15

4.smFRET分析.... 16

4.1 简介.... 16

4.2 Bursts修正.... 16

4.2.1 Alpha修正.... 17

4.2.2 Delta修正.... 18

4.2.3 Gamma修正.... 19

4.2.4 ROI模式与修正检验.... 21

4.3 FRET构象分析... 24

5.BVA.. 26

5.1 简介.... 26

5.2 BVA.. 26

附录.... 28

图像通用功能介绍.... 28

名词解释.... 30

0.简介

0.1软件总体功能

       本软件主要功能是读取“Correlation Acquisition V4.0”采集的光子时序数据，进行Burst分布分析、FRET构象及动态转换分析。

软件的布局如图0.1所示：

图 0.1 软件整体布局

软件的功能可以按照图0.1的红框内的选项卡大致分成四个部分：Data Exploration：查看数据的基本信息，包括光子时序图、E-S二维直方图等；Burst Analysis：对burst的各自特征进行统计；smFRET Analysis：对FRET效率分布进行校正及分析；Burst Variance Analysis:利用burst的方差分析样本是否存在动态的构象转换。

1.数据文件与数据读取、输出

1.1数据文件

       软件读取的数据文件仅为“Correlation Acquisition V4.0”在”Single Molecule”模式下采集数据后，保存的*.mat文件。

1.2读取文件

在读取文件前，需要将文件放入“File List”区域（图1.1的红框所示），有以下两种方法：

图1.1 File List

1.导入单个文件：点击菜单栏“File->Open File”，图1.2，然后选择一个数据文件“*.mat”，点击打开后，“File List”将出现该文件。

2.导入文件夹中所有文件：点击菜单栏“File->Open Folder”，然后选择一个存放数据文件的文件夹，选中文件夹后，“File List”将出现文件夹中所有“*.mat”文件。

双击“File List”中任意一个文件，软件出现读取数据的进度条，正在读取数据，完成后，Data Exploration模块会显示数据的基本信息，若文件中的数据不合乎要求，软件将弹出读取数据失败的提示。

图1.2 File 菜单栏

1.3文件保存与输出结果

       数据在分析完成后，可以将分析结果保存到“*.mat”文件中，具体操作为：在菜单栏点击“File->Save”，用户此时需选择保存路径和填写保存文件名，软件为另存的新文件提供默认命名，即原文件名后加上“_analyzed”。保存成功后，会出现“Save completed!”的提示，该文件中保存了用户“burst search”，“burst correction”等分析结果。

       除了将结果保存到“*.mat”文件外，数据也可以导出到excel表格，点击“File->Export”，可以将分析得到的bursts数据导出到“*.xlsx”文件中。保存成功后，会出现“Save completed!”的提示，excel表格中保存的内容如图1.3所示。

图1.3 excel表格中保存的bursts数据

2.数据勘探

2.1简介

数据勘探(Data Exploration)模块是软件启动时显示的默认模块，主要功能是让用户在读取数据后马上了解数据的整体情况，如图2.1所示，数据勘探模块主要显示3个部分的信息：区域1的光子时序信号（time-trace）展示样品发光强度及大致的浓度水平；区域2展示样品的背景信号的水平；区域3的E-S二维直方图展示样品的FRET效率和标记情况。

2.1数据勘探界面

2.2光子时序信号图

光子时序信号图显示三个通道的荧光信号随时间的变化，分别用三种颜色的曲线表示，如图2.2图。

绿色：DexDem，由donor激光器激发，donor探测器接收到的信号。

红色：AexAem，由acceptor激光器激发，acceptor探测器接收到的信号。

蓝色：DexAem，由donor激光器激发，acceptor探测器接收到的信号。

光子时序信号图的纵轴是光子计数(counts)，指一个bin time内某个通道探测到的光子数，bin time的默认值是1ms，也可以在上方的“Time-Trace Setting”中的“Bin Time (ms) ”编辑框中由用户自由设定。

光子时序信号图的横轴的显示的默认时长是1s，用户可以在下方的“Duration (s)”编辑框中改变显示时长。拖动图2.2橙色框中的滑动条，可以调整光子时序信号图的时间位置。

图2.2 光子时序信号图

“Time-Trace Setting”右边有个复选框“Show Bursts”，若点击选中，光子时序信号图中会用虚线标示出每一个burst的位置，如图2.3，其中黑色虚线标记的是burst开始的位置，而蓝色虚线标记burst结束的位置。Burst是荧光分子经过聚焦体积时，探测器突然接收到大量光子，在图中表现出一个尖峰信号。当样品的浓度处于单分子水平时，1s内通常出现1~5个burst。

图2.3 光子时序信号图中显示burst的位置

2.3背景信号

背景信号是一段时间内burst信号以外的光子信号的平均亮度，这段时间由采集过程中设置的单段采集时长决定。背景信号在读取数据后由软件自动计算，若将光子时序图的bin time调节为一个合适的值(一般大于10ms)，可以明显看到三条水平虚线，分别位于对应颜色的光子计数曲线的底部，显示每个通道的背景信号水平，图2.4。

图2.4 Time Trace图中的水平虚线显示各个通道的背景信号

       在Time Trace图的下方，“Background”区域，展示更详细的关于背景的信息。

       “Background”区域左方，Photon Delays图用于计算一段时间内三个通道的平均背景光子率，图2.5左侧。横坐标Inter-Photon Delays (ms)，指两个连续光子的时间间隔，时间间隔的定义由式2-1给出，是探测器探测到第i个光子的时刻。纵坐标Delays (counts)统计时间间隔 的出现频率。

                    (2-1)

    若样品中不存在荧光分子，探测器在单位时间内接收背景的光子数服从泊松分布，单位时间内平均光子数可以由式2-2给出：

                                                                            (2-2)

       式中代表单位时间内平均光子数，即平均光子率，是平均时间间隔。

若样品中存在少量荧光分子，中包含了由荧光所贡献的部分，此时统计平均背景光子数必须将这部分去除，考虑到荧光比起背景噪声在单位时间发出更多的光子，即荧光光子的间隔时间要远小于噪声光子。定义一个时间阈值tail time，当<tail time时，认为这个是源于荧光光子，当>tail time时，则源于背景噪声光子，因此式2-2修改为：

                        (2-3)

    式2-3，给出了由时间间隔 计算背景光子率的方式，三个通道各自的背景光子率在图例中标示。

在“Segment”中，用户可以切换显示某一个时间段内背景光子率。

“Tail Time (ms)”编辑框，用户可以在这里设定式2-3中的tail time，重新计算背景光子率，默认状态填入“Auto”，表示由软件自行确定tail time。

Photon Delays图展示了一段时间三个通道的背景光子率，而“Background”区域右方，T-BG图则显示整个实验三个通道的背景光子率随时间的变化，图中每一个点对应了Photon Delays图一个segment的背景光子率。

图2.5 Background

2.4 E-S二维直方图

E-S二维直方图是基于每一个burst（图2.3）的FRET-efficiency和stoichiometry值统计得到的。

FRET-efficiency和stoichiometry分别由式2-4和式2-5确定。

                       (2-4)

                   (2-5)

式中、、分别是一个burst中来自DexDem、DexAem、AexAem通道的光子数，γ和β是两个修正系数，将在4.4节中详细讨论。

图2.6的E-S二维直方图共统计了6440个bursts的FRET-efficiency和stoichiometry值(右上角Total Bursts所示)，上方是FRET-efficiency直方图，右方是stoichiometry直方图，中间是FRET-efficiency和stoichiometry的联合分布直方图。

Bursts可以根据stoichiometry划分为三种类（图2.6）：

1.stoichiometry值在0.8~1.2之间(绿框部分)，由式2-5，这些bursts的值很小，而是源于acceptor荧光分子的信号，说明这些分子无标记acceptor荧光分子，即属于donor-only的样品。

2.stoichiometry值在-0.2~0.2之间(红框部分)，由式2-5，这些bursts的值要远大于值，而、是源于donor荧光分子的信号，说明这些分子无标记donor荧光分子，即属于acceptor-only的样品。

3.stoichiometry值在0.2~0.8之间(黄框部分)，这些bursts的值和值相当，这部分数据是由同时标记了donor、acceptor荧光分子的分子产生的。

图2.6  E-S 二维直方图

2.5 Burst Search

Burst Search是从光子时序信号中提取出bursts的程序，软件读取数据时，会自动执行一次Burst Search，用户也可进行自定义的Burst Search。点击E-S 二维直方图上方的“Burst Search”按钮，会弹出Burst Search设置的对话框。

图2.7 Burst Search设置界面

       可以设置的参数如下：

       M：窗口大小，burst search通过一个滑动的观察窗口，在光子时序信号上依次观察每M个连续的光子，若某连续M个光子的光子率(cps)很高，则这M个光子识别为burst信号，因此，一个burst的至少包含M个光子。若M设置为一个较大的值，有可能将几个紧连的burst识别为一个burst，如图2.8。请将M设置为一个大于2的整数。

图2.8 M值对burst search的影响。左图M=10，将图中信号识别为两个burst，右图M=30，将图中信号识别为单个burst

       F：比较阈值，当窗口内连续M个光子的光子率(cps)大于背景光子率的F倍时，这M个光子被认为是处于一个burst上。请将F设置为一个大于1的数。

       BG Correction：是否对burst进行背景信号修正，若勾选此项，burst的光子数将减去背景信号的光子数。

       Fixed BG Rate: 由用户提供一个固定的背景光子率，取代软件计算的背景光子率，来执行burst search，默认为“None”，表示使用软件提供的背景光子率。

    Channel：用户选择哪些通道参与burst search，只有选中通道的光子才会出现在滑动窗口中；没有选中的通道的光子数对burst search中的阈值比较没有影响，但burst search完成后，没有选中的通道的光子也计入burst中。

       参数设置完成，点击”OK”开始burst search。

2.6 Burst Selection

Burst Selection是对burst search提取的bursts实行进一步的筛选，用户可以通过E-S二维直方图下方的三个滑动条或编辑框来设置3个阈值来实现bursts的筛选。

图2.9 Burst Selection设置滑动条

: 对burst的总光子数设置一个下限，小于这个阈值的burst将被筛除，设置该值可以去除那些非荧光信号。

: 对burst中由donor荧光分子贡献的光子数设置一个下限，设置该值，可以去除那些没有donor荧光分子标记的信号（即去除acceptor-only的信号）。

：对burst中由acceptor荧光分子贡献的光子数设置一个下限，设置该值，可以去除那些没有acceptor荧光分子标记的信号（即去除donor-only的信号）

设置不同的参数对E-S二维直方图的影响如图2.10。

图 2.10 设置不同阈值对E-S二维直方图的影响

(a) 设置阈值为 30，筛选后剩余6440个bursts；

(b) 设置阈值为 50, 筛选后剩余4118个bursts；

(c) 设置阈值为 50,为25，筛选后剩余3397个bursts，对比(b)图，下方约700个acceptor only的数据点被筛除了；

(d) 设置 阈值为 50, 阈值为25，筛选后剩余2664个bursts，对比(b)图，左上方约1400个donor only的数据点被筛除了。

3.Burst 分析

3.1 简介

Burst分析模块主要功能是产查看burst的详细信息，在选项卡点击“Burst Analysis”可以将软件界面切换至Burst分析模块。下方的表格详细罗列了每一个burst的信息，上方的直方图是基于表格数据的统计图。

图3.1  Burst分析模块

3.2 表格

       表格中每一行记录了一个burst的以下信息：

       Start (s): burst开始的时刻。

Stop (s): burst结束的时刻。

Duration (ms): burst的持续时间。

Burst Size (counts): burst包含的总光子数。

Photon Rate (kcps): burst的光子率，即每秒探测到的光子数。

 (counts)：一个burst中来自DexDem的光子数。

 (counts)：一个burst中来自DexAem的光子数。

 (counts)：一个burst中来自AexAem的光子数。

FRET Efficiency：burst 的FRET-efficiency，定义见式2-4。

Stoichiometry：burst 的stoichiometry，定义见式2-5。

3.3 直方图

       直方图对Burst的几种性质进行统计，点击下方的”X”选框，可选择直方图的统计变量，如图3.2，点击右边的“log(x)”，直方图的横坐标变成对数显示。

图3.2 改变直方图的统计变量

       直方图左方的“Y”选框可以改变直方图的归一化方式，分别为：

       Bursts: 直接统计bursts的数量，默认值。

       Probability：直方图概率归一化，选择此项时，直方图条形高度(Y值)之和为1。

PDF (Probability Density Function)：直方图概率密度归一化，选此项时，直方图条形面积之和为1。

CDF (Cumulative Density Function)：累积的密度函数的直方图，最后一个条形的高度小于或等于1。

图3.3 改变直方图的归一化方式

4.smFRET分析

4.1 简介

       smFRET分析模块包含两个主要功能：Bursts修正和FRET构象分析。点击选项卡“smFRET Analysis”，界面将切换到smFRET分析模块，图4.1。

图4.1smFRET分析模块

4.2 Bursts修正

FRET实验中需要使用两种以上的荧光染料，不同的荧光染料之间存在信号串扰和发光效率、探测效率的差异，这些因素会在FRET-efficiency的分析中引入偏差，软件提供了修正这些偏差的方法，分四步执行，如图4.2。

第一步，请点击“Correction Steps”中第一个按钮“1. Load Data”，这将数据恢复到进行参数修正前的状态。

图4.2 bursts修正流程

4.2.1 Alpha修正

       Bursts修正的第二步是alpha修正。

FRET实验要求donor荧光分子的发射光谱和acceptor荧光分子的激发光谱存在重叠，光谱的重叠使FRET存在系统的信号串扰，其中acceptor探测器接收的，由donor荧光分子发出的信号称为leakage信号，leakage信号的存在使得FRET信号强度偏高。

Alpha修正目的是消除leakage信号的影响，原理是对光子数减去一部分可能源于leakage信号的光子数，如式4-1：

                             (4-1)

上式α系数定义为：

                                 (4-2)

       式中为仅标记了donor荧光分子的样品在donor激光器激发下，donor通道探测到的荧光强度；为该样品在donor激光器激发下，acceptor通道探测到的荧光强度。为了获取α系数，可以进行额外实验或使用软件计算。

额外实验需要准备仅标记了donor荧光分子的样品，添加样品后，打开donor激光器，同时打开donor、acceptor通道的探测器，记录这两个通道的平均荧光强度、，由式4-2可算得到α系数，之后，在“Correction Coefficient”的“Alpha”编辑框中输入这个结果。

       而在软件中执行alpha修正的方法是，当E-S二维直方图中存在donor-only的数据集群时（参考2.4节），点击“2. Alpha Correction”按钮，E-S二维直方图中会出现一个红色虚线的方框(一般位于stoichiometry值为0.8~1的位置）。用户可以通过改变“Boxed Area”中四个参数，或点击E-S二维直方图下方的红色方框按钮后，在图中拖动鼠标，来改变红色虚线的方框的位置及大小，当红色方框刚好包围全部donor-only的数据集群时，软件计算出alpha系数，如图4.3中算得当前的alpha系数为0.12。

图4.3 Alpha 修正

4.2.2 Delta修正

Bursts修正的第三步是delta修正。

FRET 实验中，acceptor荧光分子有可能直接被donor激光激发，发出称为dir-excitation的信号，和leakage信号相似，dir-excitation的存在也会导致FRET信号强度偏高

Delta修正目的是消除dir-excitation信号的影响，原理是对光子数减去一部分可能源于dir-excitation信号的光子数，如式4-3

                           (4-3)

式(4-3)的δ系数定义为：

                              (4-4)

       式中为仅标记了acceptor荧光分子的样品在donor激光器激发下，acceptor通道探测到的荧光强度；为该样品在acceptor激光器激发下，acceptor通道探测到的荧光强度。为了获取δ系数，可以进行额外实验或使用软件计算。

额为实验需要准备仅标记了acceptor荧光分子的样品，添加样品后，打开donor激光器，打开acceptor通道的探测器，记录此时的平均荧光强度，然后关闭donor激光器，打开acceptor激光器，记录此时的平均荧光强度，由式4-4算得δ系数，之后，在“Correction Coefficient”的“Delta”编辑框中输入这个结果。

       在软件中执行delta修正方法是，当E-S二维直方图中存在acceptor-only的数据集群时(参考2.4节)，点击“3.Delta Correction”按钮，E-S二维直方图中会出现一个红色虚线的方框(一般位于stoichiometry值为-0.2~0.2的位置）。用户可以通过改变“Boxed Area”中四个参数，或点击E-S二维直方图下方的红色方框按钮后，在图中拖动鼠标，来改变红色虚线的方框的位置及大小，当红色方框刚好包围全部acceptor-only的数据集群时，软件计算出delta系数，如图4.4中算得delta系数为0.08。

图4.4 Delta 修正

4.2.3 Gamma修正

Bursts修正的第四步是Gamma修正。

Donor、acceptor荧光分子的量子效率及它们被探测器探测的效率存在差异，在计算FRET-efficiency时(式2-4)，通过引入γ系数来抵消这些差异：

                                                               (4-5)

式中、分别是donor、acceptor荧光分子的量子效率，、分别是donor、acceptor荧光分子被探测器接收的效率。

软件中Gamma修正流程如下：点击“4.Gamma & Beta Correction”按钮，此时弹出一个提示框，图4.5，提示用户需要选择同时标记两种荧光分子（参考2.4节），并且至少存在两种FRET-efficiency（如图4.6的FRET-efficiency直方图中存在两个高斯峰）的数据集群。使用红色方框确定数据区域后，软件计算出gamma、beta系数，图4.6。

图4.5 Gamma 修正提示

图4.6 gamma 修正

图4.6中，红色方框中的红色曲线由式4-6给出，式4-6通过拟合两个种类以上FRET-efficiency的数据点估计γ、β系数。

           （4-6）

上式中的β系数表明实验中donor、acceptor激光的功率情况，当donor激光功率对于acceptor激光功率偏高时，β<1，E-S二维直方图数据整体往上偏移，当acceptor激光功率对于donor激光功率偏高时，β>1，E-S二维直方图数据整体往下偏移。

4.2.4 ROI模式与修正检验

       经过Alpha、Delta、Gamma修正后，Alpha、Delta、Gamma、Beta系数的计算结果都在“Correction Coefficient”中列出，用户也可以直接在编辑框中直接输入或修改这些修正系数。点击“Apply”按钮，软件将使用Alpha、Delta、Gamma、Beta系数的当前值来进行burst修正，并自动筛除donor-only及acceptor-only的数据，如图4.7左。点击“Reset”按钮，数据将恢复到修正前的状态，图4.7右。

图4.7 （左）修正后 （右）恢复到修正前

点击“ROI”按钮，smFRET分析模块将切换至ROI模式，在ROI模式下，使用“Boxed Area”来选中数据区域将不会更新任何修正系数，用户点击E-S二维直方图下方的红色方框按钮，或在“Boxed Area”中修改参数来查看E-S二维直方图中任意部分的数据。

修正检验：

在ROI模式下，可以通过选中donor-only、acceptor-only部分的数据来验证修正结果是否可靠，为此，要保证当前存在 donor-only及acceptor-only的数据：点击左下角的“Burst Selection”，在对话框中将的阈值去除，将的阈值去除，如图4.8左，点击“OK”后关闭对话框；E-S二维直方图中恢复了donor-only及acceptor-only的数据，图4.8右。

图4.8 （左）设置“Burst Selection”以恢复donor-only及acceptor-only的数据 （右）恢复了donor-only及acceptor-only的数据的E-S二维直方图

(1)验证alpha修正：

对于donor-only的样品，其光子数来源于leakage信号，若alpha修正的结果正确，这部分光子数应修正为0，由式2-4可知，此时FRET-efficiency也接近0。因此，在E-S二维直方图选中donor-only的部分（如图4.9红色虚线方框选中的部分），选中后，查看FRET-efficiency直方图的峰值位置，若直方图在在0附近达到峰值，说明alpha修正准确（如图4.9中黄色方框提示，可以在“Fitting Models”中选择“One Gaussian”，此时软件会对直方图进行单高斯拟合，查看右侧的“Fitting Result”的“Center参数”，进一步确认FRET-efficiency的峰值位置）。

图4.9 验证alpha修正

(2)验证delta修正：

对于acceptor-only的样品，它的光子数来源于dir-excitation的信号，若Delta修正的结果正确，光子数修正为0，另外，acceptor-only样品的光子数也为0，由式2-5可知，经过delta修正后stoichiometry值为0。因此，在E-S二维直方图选中acceptor-only的部分（如图4.10红色虚线方框选中的部分），选中后，查看stoichiometry直方图的峰值位置，若直方图在0附近达到峰值，说明delta修正准确（如图4.10中黄色方框提示，可以在“Fitting Models”中选择“One Gaussian”，查看右侧的“Fitting Result”的“Center参数”，进一步确认stoichiometry的峰值位置）。

图4.10 验证delta修正

(3)验证gamma修正

若gamma、beta系数的计算正确，对于拥有不同FRET-efficiency的样品，它们的stoichiometry应都等于0.5。在E-S二维直方图选中同时标记了两种荧光分子的部分（如图4.11红色虚线方框选中的部分），选中后，选中后，查看stoichiometry直方图的峰值位置，若直方图在0.5附近达到峰值，说明gamma修正准确（如图4.11中黄色方框提示，可以在“Fitting Models”中选择“One Gaussian”，查看右侧的“Fitting Result”的“Center参数”，进一步确认stoichiometry的峰值位置）。

图4.11验证gamma修正

4.3 FRET构象分析

       在经过系数修正后，可以获得比较准确的样品的FRET-efficiency分布信息。由于感兴趣的往往是只标记两种荧光分子的样品的数据，可以在ROI模式下选中感兴趣的数据区域，或者使用“Burst Selection”设置阈值来筛除donor-only、acceptor-only的数据。

在FRET-efficiency直方图上方的Fitting Model选框中可以选择“One Gaussian”、“Two Gaussians”、“Three Gaussians”模型来拟合直方图数据。右方的“Fitting Result”显示当前一次拟合的结果，图4.12。

图4.12 选择拟合模型拟合直方图

其中的参数解释如下：

Root Mean Square Error：直方图和拟合模型的拟合残差的平均平方根

Chi Square: 拟合误差的卡方值

Center: 单高斯分布的峰值横坐标，括号的内容为95%置信区间。

Sigma: 单高斯分布的标准差，括号的内容为95%置信区间。

Amplitude：当前一个高斯峰的面积占比（单高斯模型无此参数），括号的内容为95%置信区间。

在FRET-efficiency直方图上方存在一个R₀ (nm)编辑框，用户如果在此输入荧光染料的Förster半径，软件按式4-7将FRET-efficiency转化为荧光染料之间的距离R，FRET-efficiency直方图将转换为距离R的直方图，图4.13。

图4.13 转换为距离R的直方图

                （4-7）

       由式4-7可知，当荧光染料之间的距离R等于Förster半径R₀时，FRET-efficiency为0.5；且FRET-efficiency随着距离R的增大而快速下降。

5.BVA

5.1 简介

       Burst Variance Analysis(BVA)是一种分析FRET分布是否存在动态转换的方法，其主要想法是将一个burst分割为若干个连续的子bursts（sub-bursts）,每个sub-burst由n个、光子组成（光子不计入这n个光子）。这些sub-bursts中与n的比例称为，式5-1，将的标准差于与理论散粒噪声的极限(theoretical shot-noise-limited standard deviation)标准差对比，若的标准差大于理论值，说明FRET的波动是FRET构象的动态转换造成。

                                                                                         (5-1)

       若一个burst的构象稳定，其内在的FRET效率为，则其内部任意n个连续的光子中，光子数服从期望值为的二项分布，式5-2：

                                  (5-2)

       的标准差理论值由式5-3给出：

                                                             (5-3)

5.2 BVA

       BVA需要burst中的光子数未经过任何修正，并且不包含donor-only、acceptor-only的数据，软件在读取数据后自动对数据进行处理，使其适用于BVA，用户在选项卡点击“Burst Variance Analysis”可以将软件界面切换至BVA模块：

图5.1 BVA结果

       图5.1下方-σ分布图反映了每个burst的的标准差及分布情况，左侧的编辑框n让用户改变sub-burst的大小，黑色的半圆弧虚线是式5-3给出的的标准差理论值分布，红色三角形的高度代表一个区域内的标准差的平均值，若红色三角曲线明显处于黑色虚线上方，说明实际的波动超出理论值，FRET构象可能存在动态变化。

       BVA模块中提供了同Data Exploration模块相似的Burst Search及Burst Selection功能，BVA模块使用的数据独立于其它三个模块，因此调节Burst Search及Burst Selection的参数不会影响其它三个模块的数据。

附录

图像通用功能介绍

       软件中所有的图像都适用以下功能：放大（zoom in）、缩小（zoom in）、拖动（pan）、数据游标（data cursor）、保存（save）。

图1. 图像工具栏，位于菜单栏下方，从左到右分别是放大、缩小、拖动、数据游标四个工具

       放大：点击按钮，进入图像放大模式，此时鼠标移动到任意图像上时，将变成十字样式，用户按住鼠标左键，拖动鼠标，图像中将出现一个虚线方框，放开鼠标左键，方框内的部分将放大到整个图像。在放大模式下，右击鼠标，出现一个菜单，图2，由上至下分别是缩小（点击后图像缩小一个规模）、恢复到原图像（点击后恢复到原图像）、自由放大（默认的放大模式）、水平缩放（点击后进入水平缩放模式，此模式下单击或滑动鼠标滚轮仅在水平方向放大或缩小图像）、垂直缩放（点击后进入垂直缩放模式，此模式下单击或滑动鼠标滚轮仅在垂直方向放大或缩小图像）。在放大模式下，点击按钮，退出放大模式。

图2. 放大模式下的右击菜单

       缩小：点击按钮，进入图像缩小模式，此时鼠标移动到任意图像上时，将变成放大镜样式，点击鼠标左键，以点击位置为中心缩小图像，若图像是原尺寸大小，则无效。在缩小模式下，点击按钮，退出缩小模式。

       拖动：点击按钮，进入图像拖动模式，此时鼠标移动到任意图像上时，将变成手样式，用户按住鼠标左键，拖动鼠标，图像会随鼠标移动。在拖动模式下，右击鼠标，出现一个菜单，图3，恢复到原图像（点击后恢复到原图像）、自由拖动（默认模式）、水平拖动（点击后进入水平拖动模式，此模式下只能水平拖动图像）、垂直拖动（点击后进入垂直拖动模式，此模式下只能垂直拖动图像）。在拖动模式下，点击按钮，退出拖动模式。

图3. 拖动模式下的右击菜单

       数据游标：点击按钮，进入数据游标模式，鼠标移动接近图像上的数据点时，变成十字样式，点击鼠标左键，该数据点的坐标将被显示，图4，用户此时可以点击键盘上的上下左右方向键，来控制数据点的位置。在数据游标模式下，右击鼠标，显示菜单，图5，由上至下分别是选择模式（可选由鼠标位置确定、 由最靠近鼠标位置确定）、数据游标的显示方式（小窗口显示坐标、图上显示坐标）、新建数据游标（点击后可创建多个数据游标）、删除数据游标（点击后删除最新的数据游标）、删除所有数据游标、输出数据游标到工作空间（无效功能）、编辑文本升级函数（无效功能）、选择文本升级函数（无效功能）。在数据游标模式下，点击按钮，退出数据游标模式。

图4. 数据游标显示数据点坐标

图5. 数据游标模式下右击菜单

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图6. Save菜单

名词解释

FRET: Förster resonance energy transfer 荧光共振能量转移

smFRET: single-molecule FRET 单分子荧光共振能量转移

burst：荧光分子经过聚焦体积时，探测器短暂的接收到大量光子信号，从光子时序图看，此时出现一个尖峰信号。

ALEX：alternating laser excitation，激光交替激发，指同过调制将两个不同波长的连续激光器交替地打开和关闭。

Time-Trace: 光子时序图，将不同时间内探测到的光子数进行可视化。

DexDem: 在ALEX模式下，由donor激光器激发且由donor探测器接收的光子信号。

DexAem: 在ALEX模式下，由donor激光器激发且由acceptor探测器接收的光子信号。

AexAem: 在ALEX模式下，由acceptor激光器激发且由acceptor探测器接收的光子信号。

: 一个burst中来自DexDem的光子数。

: 一个burst中来自DexAem的光子数。

: 一个burst中来自AexAem的光子数。

Donor-only：指一个burst的光子全都来源于donor荧光分子。

Acceptor-only：指一个burst的光子全都来源于acceptor荧光分子。

Alpha(α): 用于衡量donor荧光泄露到acceptor探测通道的比例。

Delta (δ): 用于衡量acceptor荧光分子被donor激光直接激发的比例。

Gamma (γ): donor、acceptor荧光分子的量子产率、探测效率之别。

Beta(β): 用于表示donor、acceptor激光器的相对强弱。

BVA：Burst Variance Analysis。