光学分子互作分析四大技术：SPR、BLI、MST、FCS 终极对比指南

发布时间：

2026-03-30

分类：

行业新闻

在生命科学研究和药物研发领域，精准解析生物分子间的相互作用是理解生命机制、开发创新药物的关键。面对SPR、BLI、MST、FCS这四大主流光学分子互作分析技术，你是否也曾陷入选择困难？今天，我们来一场深度对比，帮你找到最适合的研究利器！

技术对比列表

基本原理

光学分子互作分析技术可分为两大类：1）基于探针表面光学信号的SPR与BLI技术；2）基于样品荧光信号的MST与FCS技术。SPR与BLI技术分别通过监测纳米金膜或光纤探针表面因分子互作导致的折射率或光程差变化以实时追踪分子结合反应并获得动力学常数k_on与k_off值，从而计算分子互作的解离常数：K_D=k_off/k_on。MST与FCS技术则分别通过分析溶液中分子互作导致的样品热泳动或自由扩散速率变化测得分子结合反应的K_D值。其中，FCS技术又分为荧光自相关（FCS）与荧光交相关（FCCS）光谱技术；前者需对分子互作的一方（通常分子量较小）作荧光标记，后者需对分子互作双方分别作两种不同颜色（尽量避免信号窜扰）的荧光标记。FCCS技术本质上是两种不同颜色（比如绿色与红色）荧光信号在一个微小样品体积（~1fL）内的高精度（~20ns）时间共定位分析方法，即分子互作导致相应的绿色与红色荧光信号在同一时间被探测。SPR与BLI技术在固体表面分析分子互作，而绝大多数生物大分子的相互作用发生在溶液三维空间。因此，基于溶液样品的MST与FCS方法是分子互作分析领域的关键互补技术。

样品准备

SPR与BLI技术需将样品分子固定在纳米金膜芯片或光纤探针表面，而MST与FCS技术则对样品分子进行化学小分子（Alexa488、Atto655等）或荧光蛋白（EGFP、mCherry等）的荧光标记。SPR与BLI实验需要纯度极高的固定相样品分子，对流动相样品的纯度要求相对较低，且不兼容细胞裂解液等生理样品。MST与FCS技术则兼容细胞裂解液等生理样品，且应用分子生物学技术（比如质粒转染、HaloTag等）对样品分子进行荧光标记而无需样品纯化。

样品浓度与体积

SPR实验的流动相分子浓度可低至pM级别，而BLI的灵敏度更低需nM级别。MST的荧光标记分子浓度低至10nM，而FCS实验的样品浓度下限为10pM。FCS设备应用于单分子分析时，理论上无样品浓度下限。单次SPR与BLI实验需要≥30μL的流动相样品，并进行5-8个浓度梯度实验。同样地，MST与FCS实验需制备8-16浓度梯度的未标记样品以确定分子结合反应K_D值，但单次实验的最小样品体积为5μL。重要的是，FCCS技术只需单个处于分子结合平衡态的样品，只需一次实验（无需浓度滴定）可测得分子互作K_D值。

检测速度与通量

取决于分子结合与解离速度，单次SPR实验时长为0.5-2小时，完整动力学实验需测试5-7个浓度梯度样品；高配版设备配置8个并行检测通道，可适配96/384孔样品盒的高通量检测模式。单次BLI实验时间为数分钟至十数分钟，完整实验需要5-7个浓度梯度样品；最高配置16个并行检测通道，可适配96/384孔样品盒的高通量检测。单次MST实验时长为3-5分钟，完整的浓度梯度结合曲线需要8-16个样品；可实现16个毛细管样品容器（8样品+8对照）的并行检测，但无法适配96/384孔样品盒。单次FCS实验时间可短至数秒，完整实验需要8-16个浓度梯度样品；目前的FCS设备只有一个检测通道，但可适配16/96孔样品盒。关键是，FCCS实验只需单个样品，只需单次实验最快10秒测K_D值。

分析结果

SPR与BLI实验检测分子结合反应的动力学常数k_on与k_off。SPR技术的时间分辨率最高（0.01-1秒），可解析快速分子结合或解离过程。而BLI实验需将光纤探针浸没入溶液样品，其机械运动与样品平衡时间>1秒，不适合分析快速分子互作。FCS实验检测分子动力学常数的时间分辨率与BLI技术类似（≥1秒）。但MST与FCS主要通过浓度梯度实验测分子互作K_D值；FCCS实验只需单一样品及一次实验测K_D值。针对分子互作亲和力指标（K_D值），SPR适合分析的K_D值范围为pM-μM，BLI为nM-mM。MST可分析的K_D值范围为pM-mM；而FCS技术具单分子灵敏度，K_D值范围拓展至fM-mM。

多维度表征

SPR与BLI技术的主要功能是检测分子结合反应的动力学常数k_on与k_off值，可在建立标准浓度曲线的前提下可测样品浓度。MST技术的主要功能是检测分子结合反应的解离常数K_D值，也可在建立标准浓度曲线的前提下可测样品浓度。而FCS技术无需建立标准浓度曲线，单次实验可测定荧光标记样品的摩尔浓度。同一FCS实验还可检测样品的自由扩散系数，并通过Stokes-Eisteain公式计算其流体力学半径（与DLS技术类似）。此外，FCS设备具备单分子荧光信号检测能力，可实现交替激光激发单分子荧光共振能量转移（ALEX smFRET）技术以分析生物大分子的动态构象。

耗材成本与国产设备

SPR耗材成本最高，进口芯片的价格为2000-6000/个；该技术也是国产化重点，近年来涌现了极曈、量准、英柏等国产厂家。BLI耗材主要为光纤传感器，单根价格为50-500元；小鳄生物国产厂家掌握了BLI核心技术。MST毛细管价格为5-30元/根，但其标记试剂盒价格为3000-6000元，可进行约5次样品荧光标记；国产MST设备目前尚未有中标记录。FCS技术通常适配高端激光扫描共聚焦显微镜（Zeiss、Leica等），可在单个活细胞内检测荧光标记分子的浓度、荧光亮度和扩散系数。广东中科奥辉科技有限公司开发了不依赖于显微镜的全球首款桌面式FCS分子互作分析仪，产品已销往美国国立卫生研究院、麻省大学医学院、加州大学旧金山分析、阿斯利康、清华大学、北京大学、中科大、浙江大学、中科院等国内外40+用户。FCS设备的最常用耗材为显微镜盖玻片，价格约为1元/片。中科奥辉开发了国产样品标记试剂盒，价格为进口产品的1/3-1/2。

总结

单一技术无法解决分子互作分析领域的所有问题。比如，MST/FCS弥补了SPR/BLI无法在生理溶液三维空间分析分子互作的技术缺陷；BLI的检测灵敏度更低，但加强了分子互作分析速率与通量。MST技术易出现假阳性结果（荧光标记与未标记样品都有热泳动效应）；因此，对每个浓度梯度样品都需设置对照实验。此外，MST实验的升温条件可能导致生物样品的变性聚集，干扰实验数据分析。而FCS实验在恒定温度条件下进行，并可设置1-2秒单次实验并重复上百次以排除聚集颗粒对实验数据的干扰。重要的是，MST与FCS的浓度梯度实验都需要纯化未标记样品。而基于荧光蛋白标记(比如EGFP、mCherry)细胞裂解液样品的FCCS实验是唯一不需要样品纯化的分子互作分析方法，并可通过一个微量（≥μL）样品及一次实验最快10秒测得分子互作K_D值。