荧光相关光谱技术在单个活细胞内定量测定内源性蛋白质的浓度和解离常数
发布时间：
2023-05-06
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日本国立自然科学研究院Kazuhiro Aoki团队应用荧光相关光谱技术（FCS、FCCS）在单个活细胞内定量分析内源性蛋白分子的浓度和解离常数。
传统体外生化实验并不能反映细胞内蛋白浓度、相互作用的真实水平，而内源性蛋白的荧光标记十分困难。针对这些研究难点，作着首先通过CRISPR/Cas9技术对Hela细胞中的内源性蛋白ERK2和RSK2进行荧光标记，应用FCS、FCCS技术在单个Hela细胞内测定了ERK2-mEGFP和RSK2-HaloTag-TMR两种内源性融合蛋白的浓度和解离常数。
已知FBS和EGF均能刺激细胞质中ERK2的核易位，为验证内源性融合蛋白表达的有效性，作者应用荧光显微镜成像的方法观察在FBS或EGF刺激下Hela细胞中ERK2-mEGFP和RSK2-HaloTag-TMR的分布变化；此外作者应用FCS技术测定了细胞内的测量噪声并证实蛋白浓度在细胞内的变异性大于细胞间的变异性，以说明内源性融合蛋白浓度、解离常数测量数据的有效性。
实验测定了198个Hela细胞内的蛋白浓度和解离常数，通过自相关分析得到ERK2-mEGFP和RSK2-HaloTag-TMR的平均浓度为0.078μM和0.097μM，估算出一个Hela细胞中ERK2和RSK2的总浓度分别为0.68μM和0.50μM；通过交相关分析得到ERK2-mEGFP和RSK2-HaloTag-TMR之间的体内平均Kd值为0.59μM。为进一步研究EGF刺激细胞后内源性蛋白的信号转导机制，作者使用FCS、FCCS测定了细胞质/细胞核中两种内源性融合蛋白浓度、解离常数随时间的变化，结果显示EGF刺激后ERK2-mEGFP从细胞质转移到细胞核中，在EGF刺激后10min，细胞质中的Kd值瞬时增加，复合物在细胞核中更稳定。
文章建立了一种利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术和FCS/FCCS定量测定活细胞内源蛋白质浓度和分子互作解离常数的方法，解决了活细胞内源性蛋白荧光标记困难、在活细胞环境中原位分析分子机制的难题；与传统外源性蛋白荧光标记方法相比，该方法能够真实反映细胞内的蛋白浓度等参数，为活细胞分子机制动力学建模提供准确的输入参数，同时表明FCCS是一种可用于活细胞原位分子互作分析的技术，在药物研发领域具有重要意义。
Abstract
Kinetic simulation is a useful approach for elucidating complex cell-signaling systems. The numerical simulations required for kinetic modeling in live cells critically require parameters such as protein concentrations and dissociation constants (Kd). However, only a limited number of parameters have been measured experimentally in living cells. Here we describe an approach for quantifying the concentration and Kd of endogenous proteins at the single-cell level with CRISPR/Cas9-mediated knock-in and fluorescence cross-correlation spectroscopy. First, the mEGFP gene was knocked in at the end of the mitogen-activated protein kinase 1 (MAPK1) gene, encoding extracellular signal-regulated kinase 2 (ERK2), through homology-directed repair or microhomology-mediated end joining. Next, the HaloTag gene was knocked in at the end of the ribosomal S6 kinase 2 (RSK2) gene. We then used fluorescence correlation spectroscopy to measure the protein concentrations of endogenous ERK2-mEGFP and RSK2-HaloTag fusion constructs in living cells, revealing substantial heterogeneities. Moreover, fluorescence cross-correlation spectroscopy analyses revealed temporal changes in the apparent Kd values of the binding between ERK2-mEGFP and RSK2-HaloTag in response to epidermal growth factor stimulation. Our approach presented here provides a robust and efficient method for quantifying endogenous protein concentrations and dissociation constants in living cells.
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