荧光相关光谱技术在微升细胞裂解液中一步分析蛋白质复合物
发布时间：
2023-05-06
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德国图宾根大学分子生物学系细胞生物学跨文化研究所Roland Brock团队应用荧光相关光谱技术（FCS & FCCS）和免疫荧光标记法在微量细胞裂解液中定量分析内源性蛋白分子的相互作用。传统研究内源性生物分子相互作用的实验技术（比如免疫共沉淀；Co-IP）的实验过程繁琐并容易忽略弱分子相互作用。针对这一科研关键点和难点，作者首先在鼠源3a9细胞中表达了融合蛋白ZAP-70-YFP，之后使用钒酸盐（PV）处理细胞，应用FCS/FCCS技术验证了融合蛋白ZAP-70-YFP能与受体表面的膜蛋白CD3ε结合。为排除外源性表达蛋白可能导致的假阳性结果，作者应用特异性抗体对内源性蛋白进行荧光标记，FCS/FCCS实验结果显示酪氨酸激酶ZAP-70在PV刺激下可与CD3ε发生相互作用。为进一步研究PV刺激细胞后内源性蛋白的信号传导机制，作者使用FCCS技术研究了未转染的鼠源3a9和人源Jurkat细胞；结果显示：在3a9细胞中，检测到信号蛋白GRB2和PLCγ1与骨架蛋白LAT存在相互作用（+PV）；在Jurkat细胞中，GRB2-LAT未检测到互作，但LAT-PLCγ1、SLP-76-PLCγ1存在相互作用（+PV）。最后，作者将以上新技术示范应用于细胞裂解液样品的多肽药物筛选。本文展示了一种仅需在微量细胞裂解液中加入一抗和荧光标记二抗，然后应用荧光相关光谱技术快速、定量分析分子互作的实验新技术。与传统技术（例如CO-IP）相比，FCS/FCCS方法具有样品量少、操作简单、无需样品纯化等优点，对基础生物学研究和药物筛选具重要意义。
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